轉染試劑是一種非脂質體轉染試劑,廣泛適用于轉染各種細胞系,且細胞毒性非常低。由于使用該轉染試劑轉染時不要求去除血清或培養液,并且轉染后也不要求換液去除,因而使用起來非常方便。
轉染試劑瞬時轉染方法:
1. 接種細胞:轉染前一天,用膠原酶消化細胞并計數。調整細胞濃度,將細胞鋪入細胞培養的器皿,每個孔置入的細胞量應能使轉染時細胞匯合度達到 70~80%。
2. 準備 DNA-PEI 復合物: DNA、EZ Trans 試劑和稀釋劑在進行以下步驟前需先使其升至室溫。依據下表所示,用 Opti-MEM ITM(Invitrogen)或其他適合的無蛋白培養基稀釋適量 DNA。用同樣的培養基稀釋EZ Trans 試劑。每 1 μg DNA 需用2-5 μL EZ Trans轉染試劑。一邊輕輕渦旋裝有 DNA 溶液的試管,一邊將稀釋的EZ Trans轉染試劑滴加至試管中(注意:請勿顛倒添加順序)。充分混勻后,室溫靜置 10~25 min 以形成DNA-PEI復合物。當溶液體積較大時,請用圓底聚丙烯管,例如 Falcon 5 mL /14 mL 離心管。
3. 轉染細胞:直接向每個孔中加入 DNA-PEI復合物并輕輕渦旋培養板/培養皿。在無血清條件下轉染時,去除生長培養基,替換成無血清培養基,然后滴DNA-PEI復合物。轉染 3 h 后,添加1/2體積的包含 30%血清的生長培養基。
4. 孵育細胞和分析結果:在 CO2培養箱中 37℃下孵育細胞至可以分析檢測。轉染后zui快 7h 即可檢測到轉入基因的表達。請自行確定檢測時間。
轉染試劑的使用注意事項:
轉染前須保證FuGENE® 6溫度已經達到室溫,使用前須上下顛倒數次進行簡單混勻。建議使用標準的24孔板作為FuGENE® 6轉染試劑的支架。請不要將原瓶中的FuGENE® 6進行分裝。盡可能減少FuGENE® 6原液與塑料制品的表面接觸。不要使用硅化的槍頭或離心管。在稀釋FuGENE® 6時,請務必保證將FuGENE® 6直接混入培養基,而不要接觸到離心管。